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行業新聞

2019-08-29液相色譜中的溶劑效應---成因及影響因素

在色譜理論中,樣品作為一個點被引入色譜系統中,不占有體積,屬于理想狀態。實際操作中,這是不可能實現的,通常的做法是把目標物或含目標物的基質溶解在溶劑里面,然后將其注入色譜系統。在液相色譜法中,進樣體積處于0.1-100μl之間,絕大多數情形處于1-20μl之間(注:理想的進樣體積視色譜柱柱床截面積或柱床體積而定),甚至小于一顆露珠。然而這個體積相對于HPLC的流動相規模卻是不容忽略的。今天,筆者以理論為指導以實測為依據,闡述一下樣品溶劑對液相色譜分離的影響。

 

1.溶劑效應的成因

化學分析中,選擇樣品溶劑時,溶解性是首要的考慮因素,其次還應考慮揮發性、穩定性、毒性等因素。在液相色譜分析中,則還應考慮樣品溶劑與分離模式的契合性。

液相色譜法中,樣品溶劑類型的選擇通常有兩種情形:其一,流動相溶解目標物,多見于一種或極性相近的幾種目標物測定;其二,非流動相溶解目標物,比如天然提取物中未知物探索、極性差別較大的多種目標物分析、某些液體物質直接進樣(比如酒類成分分析、水中污染物分析)等。

流動相或初始比例流動相溶解樣品可以看作樣品處理的理想狀態,只要未發生體積過載(注:進樣體積超過柱體積的1%時,即存在體積過載風險)或濃度過載,一般可以得到完美的結果。當樣品溶劑與流動相的洗脫強度差別較大時,液相色譜的表現則會遭遇一些麻煩。樣品溶劑與流動相洗不一致時又存在兩種情形:其一,洗脫強度明顯強于流動相;其二,明顯弱于流動相。

簡單概括,強洗脫溶劑不均衡地參與了目標物的洗脫,使色譜峰保留時間整體提前,而樣品在柱前的不充分擴散導致了峰形扭曲。這種影響輕則導致峰展寬,嚴重時甚至導致峰裂分,給定性定量帶來災難。

 

2. 溶劑效應的影響因素

溶劑效應若想造成巨大災難的一個前提條件是:樣品溶劑的洗脫強度應明顯強于流動相,否則,即使抵達柱頭時目標物溶解在兩種溶劑中,但由于洗脫強度接近,它們在隨后的洗脫過程也不會拉開距離,也就不會裂分,甚至不會展寬。

樣品抵達柱頭的過程中,均存在樣品向周圍流動相擴散的過程,出于抑制柱外展寬的目的,分析者希望抑制這種擴散。如果目標物溶解在流動相或與流動相強度相近的溶劑中,抑制柱外擴散能提高柱效利于分離。二者洗脫強度差別大時,如不能讓目標物完全擴散至流動相,溶劑效應很可能發生。

目標物擴散的驅動力包含三部分:依靠濃度差從樣品溶劑向流動相傳質、隨樣品溶劑向流動相擴散、層流。層流就是液體在管路中流動時,中心部分移動快、邊緣移動慢,使柱狀樣品前部突出后部凹陷的現象,如下圖。

分子在液體里的移動不活躍,依靠濃度差的傳質速度較慢,慢的甚至可以忽略不計,除非能讓樣品半天后再進入色譜柱。盡管如此,增大管路內徑可以增大接觸面積,進而加快傳質,而延長管路長度則能延長傳質時間。管路的內部是光滑而規則的圓柱形空腔,液體流動于其中通常會產生層流,這恰恰是目標物擴散至流動相的主要推動力。同樣,管路內徑越大層流越顯著。針后柱前的管路越粗越長越利于目標物擴散至流動相。當然即使目標物在柱前完全擴散進入流動相,其所在的氛圍的洗脫強度也因樣品溶劑的參與而略強于流動相。

對于給定的方法和系統,較大的樣品體積(注:此時“樣品帶”較長)不利于目標物完全擴散至流動相,溶劑效應更明顯。而樣品溶劑洗脫強度越強時,色譜峰的裂分會加劇。即使因樣品體積小色譜峰沒裂分,保留時間也會前移的明顯。

2.1 進樣體積的影響

流動相溶解的樣品,進樣體積增加后,保留時間維持穩定,半高峰寬也基本穩定。而強洗脫溶劑溶解的樣品保留時間則隨進樣體積增大而明顯前移,直到裂分,而且峰寬也隨之增大。

對于強洗脫溶劑溶解的樣品:進樣體積較小時,擴散至流動相的目標物占絕大多數,除了保留時間略微提前,峰形以及峰寬與流動相溶解時基本一致。體積增大到一定程度,擴散至流動相氛圍的目標物與留在溶劑氛圍的目標物在數量上相當時,色譜峰分叉明顯。

當樣品體積進一步增大,絕大多數目標物進入色譜柱時是溶解在溶劑中的,前峰為主峰(如下圖)。此時,可能會給分析者一種錯覺:通過增大進樣體積或者通過更細的管路解決了溶劑的效應。殊不知,色譜峰的保留時間已經明顯提前了。任何情況下,請牢記:假如不用流動相溶解一些樣品,分析者甚至都不知道它真實的保留時間在哪里!

2.2 柱前管路的影響

柱前管路內徑越大、管路越長,越利于目標物向流動相擴散,而且使用更粗的管路比更長的管路有效(注:假設死體積相同)。雖然粗的管路加劇了等度條件下的柱外展寬,對柱效有危害,然而相較于峰分叉的危害而言,前者尚能接受。

如下圖,黑色曲線使用了0.12mm. ID * 500 mm的管路(柱前),粉色曲線使用了0.25mm ID. * 500 mm的管路(柱前),樣品溶劑均為乙腈,進樣體積均為2μl。使用細內徑管路的系統中峰開始分叉,而粗內徑管路尚能維持可接受的峰形,盡管后者存在峰展寬的情況。

       所以,在某些系統下溶劑效應更明顯,這不是儀器不好,恰恰是這個系統對管路控制的太好了,才會讓溶劑效應導致的峰形變形更明顯!

 

2.3 其他影響因素

增大洗脫體積,比如延長柱長,或降低流動相洗脫強度增加目標物的保留因子,可以抑制溶劑效應。而且,色譜柱延長以后,柱前管路導致的柱效下降能得到彌補。這種做法相當于不變更色譜柱規格的前提下,減小進樣體積。

 

2.4  特殊說明

在梯度洗脫模式下,溶劑效應不明顯,如果真的存在,也只是影響出峰較早的色譜峰。這是因為梯度洗脫下,初始比例流動相無法洗脫目標物,而且強洗脫溶劑也無法讓其快速移動,它們會富集在柱頭,等流動相洗脫強度提高到一定程度,化合物才會逐漸被洗脫。

對于某些保留弱的化合物,它的洗脫強度與初始比例流動相越接近,就越容易受溶劑效應影響。因而,為了照顧出峰較早的目標物,即使使用了梯度洗脫,也不要采用強洗脫溶劑來溶解(假如低洗脫強度溶劑能完全溶解所有目標物)(此處無圖,建議讀者嘗試,或者大多數讀者早就遇到過了。)

 

3. 溶劑效應的危害

(1) 導致柱效下降,危害分離;

(2) 危害峰形,危害定量,甚至危害定性;比如,在LCMS中,掃描前體離子時,遇到這種情況,甚至不知道哪個峰才是目標物;

(3) 當標樣和樣品的溶劑不一致時,保留時間不吻合,同樣危害定性;比如酒類成分分析,標樣溶于純水,樣品是過濾的酒,后者的溶劑就是乙醇水,它的保留時間必定早于純水溶解的標樣;再比如水中污染物分析,目標物溶于有機相得到標樣,而樣品是過濾后的天然水;

(4) 強洗脫的溶劑在基質中提取出的雜質遇流動相會析出,堵塞針座、柱前管路或色譜柱。

 

4.解決辦法

如何識別溶劑效應?

反相色譜中,溶劑極性弱于流動相;正相色譜中,溶劑極性強于流動相。這兩種情況均有出現溶劑效應的風險。溶劑效應中的峰裂分有兩個特點,裂分峰在正常色譜峰的前面,而且出峰越早的化合物裂分越明顯,出峰晚的化合物甚至不會受影響。色譜柱損壞(如篩板堵塞)導致的峰裂分,分叉峰出現在正常峰的右邊,而且這種影響會波及所有化合物。

下面是筆者給出的一些建議:

(1) 不影響目標物溶解性的情況下,盡量用流動相、初始比例流動相或洗脫強度盡量低的液體作為樣品溶劑;

(2) 在不影響目標物溶解的情況下,用弱洗脫強度的溶劑稀釋樣品,比如反相色譜法下,向有機溶劑中加水;

(3) 為了滿足多種目標物的提取或溶解度,必需使用強洗脫溶劑時,比如天然產物分析,在不影響靈敏度的情況下降低進樣體積;

(4) 如果不想減少進樣體積也不想更改溶劑,可將初始流動相洗脫強度設置的較高,使初始流動相的洗脫強度與溶劑接近,然而這種方法可能會危害化合物的分離;

(5) 在不影響分離的情況下,柱前改用較粗內徑管路;(注意:假如是等度洗脫,此方法會降低柱效;假如是梯度洗脫,基本不影響柱效)

(6) 使用進樣器預混合功能。吸樣后,針不回針座,懸停空中,計量泵吸---排數次,使目標物完全擴散至流動相。(注意:假如是等度洗脫,此方法會降低柱效;假如是梯度洗脫,基本不影響柱效)

5. 低洗脫強度溶劑的影響

在主流文獻中,一般認為低洗脫強度溶劑通常不影響化合物的色譜表現,事實也是如此。然而,在一些極端情況下,微小的影響也能被發現。

當低強度溶劑中的目標物(綠色)進入色譜柱時,此部分目標物將基本不能向前移動,因為低強度溶劑無法洗脫它,后者被富集在柱頭(區域寬度被壓縮,類似梯度洗脫時的初始比例流動相)而低強度溶劑則會持續向前移動,能追趕上最前面的那部分目標物,在較小的時間段內會稍稍降低最前面那部分目標物的移動速度。前面那部分目標物中心點與中間那部分目標物中心點的最大時間差小于等于樣品體積/流速。

      隨后,后面溶于流動相的目標物也進入色譜柱,該部分與柱頭富集的目標物(下圖左邊的橢圓形譜帶)一起被流動相帶著以正常速度移動,(注:該部分以較寬橢圓形顯示是為了表明這部分目標物占大多數,并不意味它的區域寬度較寬,相反它的寬度比正常色譜峰更窄)需要注意的是中、后部分合并的那個譜帶的保留時間要略晚于正常的保留時間,進樣體積越大,保留時間延后越明顯。

   與強洗脫溶劑溶解的情形相比,低洗脫強度時,基本不會發生峰的裂分。尤其重要的是,如上圖所示,由中后兩部分組成的峰始終是主峰,并能保持較好的峰形。即使發生了前與中后部分的峰裂分,我們仍能找到主峰。

以低強度溶劑不能洗脫目標物為前提,可以大膽預測:當進樣體積極小時,進色譜柱前,目標物全部擴散至流動相,峰形完全正常(這與采用強洗脫溶劑時類似)。當進樣體積極大時,進色譜柱前,擴散至流動相的目標物占比較低,前部分目標物占比更小,主峰明顯,前面會有較小的裂分峰。只有當進樣體積不大不小的時候,才會出現明顯的裂分峰。綜合來看,低洗脫強度溶劑時對色譜峰的危害小于強洗脫溶劑。

對比了溶于流動相和純水(低強度)caffeine,與前面分析條件相同。

   由上圖可以看出,進樣體積為0.1μl0.5μl 1.0μl的分析中,色譜峰未發現裂分,但保留時間隨進樣體積增大而延后。進樣體積為1.0μl5.0μl10μl的分析中,色譜峰裂分出一小一大兩個峰,其中前面的小峰靠近真實保留時間(0.1μl的進樣看作真實保留時間),隨進樣體積增大,主峰保留時間進一步延后。這與前面關于低強度溶劑效應的機理一致。

分析者出于提高靈敏度的目的,進樣10μl,這對于2.1mm. ID, 50 mm,的色譜柱明顯體積過載了。為了得到良好峰形,將洗脫條件改為梯度洗脫,初始流動相為純水(與樣品溶劑一致,也就是純水)。問題得到完美解決(如下圖)

6,總結

(1)  強洗脫溶劑造成的溶劑效應主要是保留時間提前,峰裂分時,裂分峰在左。低洗脫強度溶劑造成的溶劑效應主要是保留時間延后,但延后幅度較小,即使發生裂分,前后兩峰均能保持良好峰形。

(2)  改用流動相溶解樣品或減小進樣體積可以消除溶劑效應;低強度溶劑稀釋樣品或梯度洗脫也是抑制溶劑效應的好辦法;柱前改用粗內徑管路或進樣前進行預混合可以將目標物擴散至流動相中,能夠挽救峰形,如果是梯度洗脫,這甚至不影響柱效。但假如是等度洗脫,這會增大目標物的柱前展寬,危害柱效,所以這兩個辦法是最后的選擇。

 彩云 色譜與質譜
備注:原文有很多圖片更清楚的說明了各種不同的情況和原理,進一步了解請閱讀原文,
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